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《拉曼光谱仪应用在乳腺癌切除边缘残留中的快速判定》

    乳腺癌的手术切除中,准确区分癌变部位是否被完全切除是手术效果的关键性因素。早前科研人员已经证实激光拉曼光谱仪可以实时区分良性与恶性组织。
    如何有效地区分乳腺癌切除边缘的健康组织与恶性组织?针对这个问题,来自哈维·穆德学院(Harvey Mudd College)的Willie C团队[1]给出了解答,他们使用了必达泰克公司的i-Raman Ex(1064 nm)和i-Raman Plus(785 nm)两种激发波长的便携拉曼光谱仪系统,证实了拉曼光谱仪可以快速准确的区分健康组织和恶性组织,这是一种开拓性的肿瘤快速诊断技术。 
一、使用拉曼光谱仪测试的方案和光谱结果:
    必达泰克生产的这两套拉曼系统的激发波长是在红外线区域,能够轻易穿透组织而不会造成损伤,并可在显微镜或手持式探头的模式下操作(图1),后续试验中均控制两个系统的总激光曝光(激光激发功率x收集时间)都等于9×103 mW-s。
    
图1.  便携拉曼系统与两种采样方式
二、使用拉曼光谱仪对肿瘤区与健康区进行区分:
    通过分析判断出必达泰克的1064 nm拉曼系统有12个特征波段、785 nm系统有17个特征波段(图2),由这些特征数据构成主成分分析(PCA)。依据算法处理不同组织的原始数据分别制成两个拉曼系统的“差异光谱”(图3),其代表了在健康组织与肿瘤组织之间的光谱差异。图3中心轴上方的值表示该区域肿瘤拉曼活性大于健康组织。低于轴的值表示健康组织拉曼活性大于肿瘤细胞。
    使用PCA-LDA对组织区域的两个光谱类别的识别,通过结果将其分为肿瘤(+)或健康(0)两类。使用1064 nm拉曼系统测定57个组织靶标区域结果为:灵敏度= 86%、特异性= 96%、准确度= 91%(图4)。使用785 nm拉曼系统测定40个组织靶标区域结果为:灵敏度= 95%、特异性= 100%、准确度= 96%(图5)。
    从测试结果可以看出1064 nm拉曼系统拥有更低荧光干扰和更深采样穿透深度,因此1064 nm拉曼系统在光谱差异性上更为优秀。而785 nm系统拥有的更高分辨率和更多光谱特征波段,实际测试结果能表现出更好的灵敏度、特异性和准确度。
   
图2.  1064 nm拉曼系统(E)和785 nm拉曼系统(C)识别健康组织和癌变组织的特征光谱区域

图3.  1064 nm拉曼系统(左)和785 nm拉曼系统(右)测得的正常细胞与癌变细胞的“差异光谱”

图4.  1064 nm拉曼系统显微下获得的细胞类型分布图与统计结果
图5.  785nm拉曼系统显微下获得的细胞类型分布图与统计结果
三、拉曼系统测定健康组织到肿瘤组织过度区域。
    肿瘤切除手术为了保证完全清除恶性组织,防止癌症复发。肿瘤周围的健康组织也会被去除。传统上手术通过肉眼检查组织来确定癌症从何处开始以及健康组织的边缘。但是,癌症组织边缘过渡区也可能含有癌细胞,这些癌细胞以肉眼无法观察到的状态与正常细胞共存。导致残留下来的肿瘤细胞很可能会致使癌症复发。因此,便携拉曼系统是否可以比显微观察法更加有效的区分癌细胞与正常细胞混合区域显得十分重要。
Willie C小组中的病理学家评估了整个癌症切块,将其区域分为健康,肿瘤或混合区域。使用785nm拉曼系统的探头对直径约为50-85μm的圆形区域进行采样。实验采用拉曼显微镜下测得4组数据作为对比,4次拉曼判别结果与医学成像分析结果具有高度相关性(图6),可认为判定基本准确可靠。
由于拉曼技术的目标应用是在外科手术过程中进行手持式肿瘤切缘检查,因此该团队在其工作中还探索了仅使用拉曼系统探头(无显微镜),并且将数据收集时间限制在10秒以将恶性肿瘤与健康组织区分开的能力。
图6.  拉曼测试与医学评估的结果对照
四、使用拉曼系统探头采集光谱并对组织进行分类
    从显微镜上取下i-Raman探头后,可以将其手持在手术室中使用。借助仪器探头自带的嵌入式触发器可启动系统采集光谱,也可以将其固定在系统自带小支架中(BAC150B,探头支架)。其集成的XY工作台,可系统地测试样本数据和记录XY坐标。
图7.  785nm拉曼系统在无显微下获得的细胞类型分布图与统计结果
    对于此实验,使用固定的探头支架和探头配合采样,限定采样时长仅为10秒既获取一次数据。切片组织使用拉曼探头直接测得鉴定结果与医学形态学分类的结果进行对比。从组织区域中57测试区域中最终结果为:灵敏度= 90%,特异性= 86%,准确度= 88%(图7)。
由结果可以看出采用拉曼探头直接采样10秒所获得的判断结果不仅具有较高特异性、灵敏度和准确度。还能做到快速鉴别组织性质的作用,其有希望应用于外科切除手术中癌变组织边缘的判断。
五、检测结果
    在这些实验中必达泰克公司生产的i-Raman拉曼系统,高度整合的方案、轻巧的体积、灵活的采样方式可以在空间有限的手术领域中使用。i-Raman拉曼系统的50-85μm光束尺寸非常适用于检测15-20个簇集的肿瘤细胞。其优秀的仪器性能使客户在10-90秒内即可获得被测区域组织的拉曼诊断数据。
目前虽然拉曼技术较难直接取代乳腺癌的标准术后病理评估。但是通过Willie C小组的工作,我们多了一种快速、准确的乳腺癌手术切除边缘的评估方法。这个方法将有可能大大降低患者术后复发和二次手术的概率。
参考文献
[1] Zuniga, Willie C., et al. "Raman Spectroscopy for Rapid Evaluation of Surgical Margins during Breast Cancer Lumpectomy." Scientific Reports 9.1 (2019): 1-16.
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